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比色法蛋白質(zhì)定量

       蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物，比色法測定的基礎是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分:氨基酸(如酪氨酸，絲氨酸)與外加的顯色基團或者染料反應，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而反應蛋白質(zhì)濃度。

比色方法一般有BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。

        Lowry 法:以早期的Biuret 反應為基礎，并有所改進。蛋白質(zhì)與Cu2 反應，產(chǎn)生藍色的反應物。但是與Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高。缺點是需要順序加入幾種不同的反應試劑;反應需要的時間較長;容易受到非蛋白物質(zhì)的影響;含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。

       BCA(Bicinchoninine acid assay)法:這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2 反應產(chǎn)生Cu ，后者與BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系*，反應后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對于Lowry法，操作簡單，敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。

       Bradford 法:這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其zui大的特點是，敏感度好，是Lowry 和BCA 兩種測試方法的2 倍;操作更簡單，速度更快;只需要一種反應試劑;化合物可以穩(wěn)定1小時，方便結(jié)果;而且與一系列干擾Lowry，BCA 反應的還原劑(如DTT，巰基乙醇)相容。但是對于去污劑依然是敏感的。主要的缺點是不同的標準品會導致同一樣品的結(jié)果差異較大，無可比性。

       某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結(jié)果并不一致，感到迷惑，究竟該相信哪種方法?由于各種方法反應的基團以及顯色基團不一，所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如:Keller等測試人奶中的蛋白，結(jié)果Lowry，BCA 測出的濃度明顯高于Bradford，差異顯著。即使是測定同一樣品，同一種比色法選擇的標準樣品不一致，測試后的濃度也不一致。如用Lowry測試細胞勻漿中的蛋白質(zhì)，以BSA作標準品，濃度1.34mg/ml，以a球蛋白作標準品，濃度2.64mg/ml。因此，在選擇比色法之前，是參照要測試的樣本的化學構(gòu)成，尋找化學構(gòu)成類似的標準蛋白作標準品。另外，比色法定量蛋白質(zhì)，經(jīng)常出現(xiàn)的問題是樣品的吸光值太低，導致測出的樣品濃度與實際的濃度差距較大。關(guān)鍵問題是，反應后1011分光光度計的重要配件-- 比色杯的顏色是有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應測試時間，所有的樣品(包括標準樣品)，都必須在此時間內(nèi)測試。時間過長，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應溫度、溶液PH值等都是影響實驗的重要原因。此外，非常重要的是，是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯，因為反應后的顏色會讓石英或者玻璃著色，導致樣品吸光值不準確。

        這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要消除320nm 的"背景"信息，設定此功能"開"。與測試核酸類似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，*的線性范圍在1.0-1.5 之間。實驗中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)"漂移"。這是一個正常的現(xiàn)象。事實上，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%，表明結(jié)果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因為Warburg 公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變，濃度就會被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾;另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。